Esta prueba consiste en la medición del la Acetilcolinesterasa y se realiza sacando una muestra del liquido amniótico del vientre materno. Esta prueba no solo nos indicara la posible existencia de una Espina Bífida, sino de la existencia de otras malformaciones. Actualmente se realiza de forma sistemática a todas las mujeres embarazadas mayores de 35 años o a mujeres con factores de riesgo.